RNA-seq原始数据质控后,是否要合并PE和SE的比对结果|《解螺旋技术交流圈》精华第1期

思考这样一个问题：“RNAseq原始的Pair-end测序数据质控之后，部分Pair-end的read变成了Single-end的read，分开比对后得到了PE的BAM和SE的BAM，这个时候要不要合并这两个BAM文件？”

关于这个问题，我们在知识星球上对此进行过讨论。现在我总结一下我们的观点。

思考问题的熊：

这个问题可能需要多几个角度考虑。
为什么质控之后双端的reads变成了单端？一种可能是因为一端的read质控确实不合格，第二种情况（通常也是更常见的）是因为因为建库的原因，去接头之后两条reads overlap，从信息量来说就变成了单端，这个时候类似trimmomatic的软件就会默认把其中一条read当作无用read而扔掉。
通常来说，因为第一种情况而过滤掉的reads是相对少的，因此扔掉并无大碍，但是第二种就出问题了。目前大多数软件都不支持直接输入PE和SE的fastq文件进行mapping，你就必须把它分开做，这个时候你要是把单端的敢扔掉其实就是扔掉了大量的信息。
怎么解决这个问题呢？目前看来比较简单的方法是直接将trimmomatic的一个参数keepBothReads 改为true ，让因为第二种原因而扔掉的reads得以保留，然后直接用pair的fastq做mapping就可以了。
这个参数的影响可以看图

解螺旋的矿工（星球中的星主：YellowTree+）：

RNAseq的数据在质控之后，有时候甚至会有多达10%的read会从Pair-end变为Single-End！！！丢掉的话，损失很大，所以要考虑留下来。我的看法和 @思考问题的熊有相似之处，不过在处理Single-End的read上有些不同。我觉得可以这样做：
过滤后，Pair-end read和Single-End Read分开各自去完成比对，得到各自的比对结果（BAM格式）；
分别计算PE的比对结果和SE比对结果在各个转录本上的覆盖数，然后把它们相加起来；
再用想在常用的基因表达分析工具（如EdgeR、DESeq等）进行下游分析；

这里在（2）中唯一要担心的是，有些SE Read覆盖的转录本也许不是最准确的那个（因为缺了另一半，你无法有效去判断），但我觉得这部分是少数，对结果不会有影响，这就是我认为可以分开比对，分别计算覆盖数再合并的原因。这样做的另一个好处是，不用太担心另一半低质量的Read误导了比对结果（不过可能这种情况也不会太多）——这也就是我和 @思考问题的熊存在差异的地方，不过我觉得熊的看法的一个好处是，处理起来会更简单一些。

CJ

@YellowTree+，支持哈。另，对于Trimmomatic处理之后产生大量单端数据，那么必然是size-selection这些步骤出问题咯。如果硬是要保留，我同样支持星主的做法。 @思考问题的熊，在此情况下，我觉得也同样有必要考虑Trimmomatic的其他参数，Trimmomatic默认的剪切模式会产生正反完全 overlap 或者更过的情况。一些比对软件，如bowtie（或者hisat）似乎是不支持的。

矿工注解：

CJ在这里指的是ILLUMINACLIP参数的“keepBothReads”参数。这个参数很重要，它的作用是R1和R2在去除了接头序列之后，如果剩余的部分是完全反向互补的，其默认参数（false），会把整条与R1完全反向互补的 R2去除，当做重复去除掉，但在有些情况下，例如这里需要用到Paired reads的时候，就要将这个参数改为 true，否则会损失一部分Paired reads。

我举个例子，看一个 PE150 数据的测试，就知道 keepBothReads 参数的重要性了：

$ java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 F-2-test_R1.fastq.gz F-2-test_R2.fastq.gz -baseout F-2.fastq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:51

ILLUMINACLIP: Using 1 prefix pairs, 0 forward/reverse sequences, 0 forward only sequences, 0 reverse only sequences
Input Read Pairs: 2500 Both Surviving: 1633 (65.32%) Forward Only Surviving: 828 (33.12%) Reverse Only Surviving: 12 (0.48%) Dropped: 27 (1.08%)
TrimmomaticPE: Completed successfully
# 使用 ILLUMINACLIP 默认的第六个参数 false，只有 65.32% paired reads 保留下来

$ java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 F-2-test_R1.fastq.gz F-2-test_R2.fastq.gz -baseout F-2.fastq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10:8:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:51

ILLUMINACLIP: Using 1 prefix pairs, 0 forward/reverse sequences, 0 forward only sequences, 0 reverse only sequences
Input Read Pairs: 2500 Both Surviving: 2439 (97.56%) Forward Only Surviving: 22 (0.88%) Reverse Only Surviving: 16 (0.64%) Dropped: 23 (0.92%)
TrimmomaticPE: Completed successfully
# 将 ILLUMINACLIP 第六个参数改为 true，其余所有参数均相同，结果有 97.56% paired reads 保留下来

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